– 193 Teilnehmer –
Organisation: Wolfgang Friedt, Rod Snowdon
Die 15. Tagungsveranstaltung der AG Genomanalyse fand vom 26. -28 Oktober 2010 an der Justus Liebig Universität in Giessen statt. Mit 193 registrierten Teilnehmer traf die Veranstaltung auf großes Interesse aus Wissenschaft und angewandter Züchtung. Den Veranstaltern aus dem Institut für Pflanzenzüchtung sei an dieser Stelle für die Ausgestaltung des wissenschaftlichen Programms, die hervorragende Durchführung und die große Gastfreundschaft aufs herzlichste gedankt. Das Tagungsprogramm war in 3 thematische Sektionen aufgegliedert und umfasste insgesamt 29 Vorträge und 43 Posterbeiträge. Das Vortragsprogramm ist nachfolgend zusammengefasst.
Session 1: DNA Sequencing & Genetic Variation
Nach der Eröffnung der Tagung durch den diesjährigen Gastgeber Prof. Wolfgang Friedt (Professur für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung) und Prof. Katja Becker, Vizepräsidentin der Justus-Liebig-Universität Giessen, gab Nils Stein ( IPK Gatersleben) mit seinem Eröffnungsvortrag “Barley – Get ready for genomics-based breeding!” eine Einführung in die Anwendungsmöglichkeiten der Genomforschung für die genombasierte Züchtung einer Kulturpflanze mit einem großen, bislang nur wenig zugänglichen Genom. Hierbei wurde u.a. das sog. “Genome Zipper”-Verfahren präsentiert, mit dem die Syntänie der Getreidegenome zu den bereits sequenzierten Reis-, Brachypodium- und Sorghum-Genomen genutzt wird, um Gersten-Gensequenzen aus sortieren Chromosomen in einer virtuellen physischen Karte anzuordnen.
Danach wurde die erste wissenschaftliche Session über “DNA-Sequenzierung und genetische Diversität” durch einen Keynote-Vortrag von Ian Bancroft (John Innes Centre, UK) eingeleitet, bei dem es um die Fortschritte in Richtung “Züchtungsvorhersagen” (Predictive breeding) im Raps ging. Dieser Vortrag zeigte ebenfalls die enorme Leistungsfähigkeit der neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien, um selbst im komplexen alloploiden Genom des Rapses homoeologe Chromosomenbereiche zu differenzieren und für die Aufdeckung und Beschreibung von züchterisch interessanter genetischer Diversität zugänglich zu machen, z.B im Form von Genomweiten SNP-Markern.
Während der Fokus in diesen Arbeiten bei der Sequenzierung des gesamten Transkriptoms mittels “RNA-Sequenzierung” (RNAseq) lag, gab Günther Kahl von der Universität Frankfurt am Main im Anschluss einen Einblick in die Nutzung der DNA Sequenzierung für die transkriptomweite Quantifizierung von RNA Transkripten. Durch die Erfassung und Quantifizierung von kurzen, genspezifischen EST-“Super-Tags” konnten u.a. artspezifische Muster in der Expression von MAP-Kinase-Genen bei der Reaktion von Leguminosen auf Infektion durch Aschochyta-Pathogene aufgedeckt werden.
Die Hochdurchsatz-Sequenzierung von kurzen, repräsentativen DNA-Fragmenten (Reduced-Representation-Sequenzierung) stand auch im Vortrag von Clare Nelson von der Kansas State Universität im Mittelpunkt. Allerdings wurden in diesem Fall kurze, polymorphe Endsequenzen von PCR-Fragmenten aus DNA-Restriktionsfragmenten (RAD-Marker) gewonnen und für die SNP-Aufdeckung in Sorghum verwendet. Anhand dieser “Genotypisierung durch Sequenzierung” sollen je nach Ansatz bis zu 480.000 Sorghum-SNP-Marker für “Nested” Assoziationsanalysen und für die genomweite Selektion in genetisch diversen Sorghum-Akzessionen zugänglich gemacht werden.
Als Beispiel für die Aufdeckung von Assoziationen zwischen DNA-Sequenzdiversität und phänotypische Variation für komplexe Merkmale berichtete Yongle Li von der Technischen Universität München in Freising von SNP-Allelen in 12 Kandidatengenen für Frosttoleranz in Winterroggen, die teilweise mit diesem Merkmal genetische Assoziationen aufwiesen. Bei diesem Vortrag und in der anschließenden Diskussion wurden u.a. die große Bedeutung von verlässlichen Phänotypdaten für genetische Analysen bzw. die große Aufwand, die mit dem die Erhebung solcher Phänotypdaten verbunden ist, unterstrichen.
Eine markergestützte Strategie zur Übertragung von “Green-Revolution” Rht-(Zwerg-)Genen in lange, jedoch durch eine erheblich bessere Fusarium-Resistenz ausgeprägte Weizenzuchtlinien, wurde durch Dragan Perovic vom Julius-Kühn-Institut in Quedlinburg präsentiert. Bis hin zu BC2-F1-DH-Nachkommenschaften wurde mit Hilfe von eng gekoppelten Markern auf erwünschte Allele bei drei Rht-Genloci selektiert, um das Zwerg-Phänotyp in verschiedene Resistenzhintergründe zu übertragen. Eine Resistenzprüfung der Nachkommen soll im nächsten Schritt den Erfolg der Merkmalskombination bestätigen.
Zum Abschluss der ersten Session gab Reinhard Töpfer in seinem Keynote-Vortrag einen Einblick in die enorme Bedeutung der genombasierte Züchtung für die Rebenzüchtung: Zur nachhaltigen Verbesserung der Krankheits- und Schädlingsresistenz bei der Weinrebe kann nach seiner Auffassung die markergestützte Rückkreuzung zur Übertragung von Resistenzgenen aus Wildreben eine Beschleunigung des derzeitigen Züchtungszyklus von über 25 Jahre um mindestens 10 Jahre beitragen. Ein beachtliche Rolle bei der Entwicklung von Markern für wichtige Resistenzloci, sowie für die potentielle Identifizierung der beteiligten Gene, spielt dabei die vollständige Sequenzierung des Vitis-Genoms und die damit eröffneten Möglichkeiten zur Hochdurchsatz-“Resequenzierung” genetischer Ressourcen.
Session 2: Genetic Mapping and Gene Funktion
Im Mittelpunkt der Sektion „Genetische Kartierung und Genfunktion“ standen Forschungsarbeiten zur Erschließung neuer Allele für agronomisch relevante Merkmale wie Ertrag, Resistenz und Qualität in einem weiten Spektrum von Kulturpflanzen.
In seinem einführenden Keynote-Vortrag berichtete Beat Keller (Universität Zürich) über ausgedehnte Untersuchungen der natürlichen allelischen Diversität in zwei bedeutenden Resistenzgenen gegen den Weizenmehltau (Blumeria graminis f.sp. tritici). Da sowohl das Gen Pm3 als auch Lr34 eine rassenspezifische Resistenz vermitteln, erwächst daraus die stete Notwendigkeit neue Allele für die Züchtung bereitzustellen. Für beide Genregionen wurde ein hoher Grad an Sequenzkonservierung beobachtet. Zudem wurden Resistenzallele nahezu ausschließlich im Kulturweizen gefunden. Dennoch konnten für das Gen Pm3 sieben bislang unbekannte funktionale Genvarianten aus Weizenlandrassen identifiziert werden. Zuvor waren 400 selektierte Weizen-Akzessionen in einem kombinierten Ansatz aus Resistenz- und Haplotypanalysen untersucht worden. Anschließende Funktionsanalysen zeigten für alle sieben Allele eine, im direkten Vergleich mit dem Hauptresistenzallel Pm3b, spätere Genaktivierung assoziiert mit einer geringeren Resistenzausprägung. Seit mehr als 40 Jahren vermittelt Lr34 eine multiple Resistenz gegen eine ganze Reihe biotropher Pilzpathogene. Umso erstaunlicher ist es, dass bisher nur zwei Lr34-Variantenidentifiziert werden konnten. Mit der Intragenischen Allel-Pyramidisierung (intragenic allele pyramiding), bei der zwei Allele eines Gens zu einem neuen Gen hybridisiert werden können, wurde eine Technik vorgestellt, die sicherlich für Wissenschaft und Züchtung gleichermaßen interessant ist, auch wenn detaillierte Kenntnisse über den Resistenzgrad des neu-synthetisierten PM3D+E Gens noch nicht vorliegen.
Eine weitere Studie zur Erschließung neuer Resistenzquellen, diesmal gegen die Septoria-Blattdürre (Mycosphaerella graminicola) des Weizens, wurde von Christiane Kelm (Universität Halle) vorgestellt. In 2009 und 2010 wurden Doppelhaploide (DH)-Linien einer Kreuzung zwischen dem resistenten Elter `Solitär´ und dem anfälligen Elter `Mazurka´ an verschiedenen Standorten in Sachsen-Anhalt, Sachsen und Bayern hinsichtlich ihrer Resistenz gegen unterschiedliche Pilzisolate analysiert. Neben der Resistenz wurden auch die relevanten Phänotypen Zeitpunkt des Ährenschiebens und Pflanzenhöhe untersucht, wobei für das Merkmal Pflanzenhöhe eine Assoziation mit zwei Resistenz-QTL auf den Chromosomen 4B und 4D dokumentiert wurde. Darüber hinaus konnten bisher unbekannte QTL-Regionen sowohl für Rasse-spezifische als auch für Rasse–unspezifische Resistenzen lokalisiert werden.
Thomas Lüpken (Julius Kühn-Institut (JKI), Quedlinburg) informierte über Fortschritte in der Feinkartierung des Bymovirus-Resistenzgens rym11 auf dem Chromosom 4H der Gerste. Anhand von 193 Rekombinanten Inzuchtlinien (RILs) konnte die genetische rym11-Region von 10,5 auf 0,2 cM reduziert werden. Da zentromernahe Genregionen aufgrund geringer Rekombination und hoher Gehalte an repetitiver DNA eine besondere Herausforderung an die kartengestützte Klonierung stellen, sollen weitere Fortschritte durch die nachgewiesene Syntänie mit dem Reischromosom 3 und durch umfassende 454 Reads aus der genomischen Zielregion erfolgen. Für die abschließende Klonierung ist die Nutzung der bis dahin verfügbaren Gerstensequenzinformationen (BARLEX, GABI-Projekt) geplant.
Die markergestützte Selektion (MAS) ist vor allem für jene Kulturpflanzen ein wesentlicher Vorteil, deren Züchtung generell zeit- und kostenaufwendig ist. Dies trifft in besonderem Maße auf die Weinzüchtung zu. In diesem Zusammenhang sollen QTL-Analysen für wesentliche Eigenschaften wie Blütenbildung, unterschiedliche Traubenparameter und Resistenzen die Effizienz der Weinzüchtung verbessern. In diesem Zusammenhang berichtete Iris Fechter (Julius Kühn-Institut (JKI), Siebeldingen) über die Identifikation von QTL-Regionen für die Mehltauresistenz (Falscher Mehltau; Plasmopara viticola) und für die Regulation des Blühzeitpunktes, sowie über die molekulargenetische Analyse eines auf Chromosom 2 gelegenen geschlechtsbestimmenden Genlocus (Sex-Locus). Für die molekulare Klonierung der identifizierten QTL-Regionen soll das Genom der Rebsorte `Börner´ an der Universität Bielefeld sequenziert werden.
Zwei Beiträge zur Zuckerrübenforschung widmeten sich der Bedeutung von Regulationsgenen der Blüte und des Schossens für die Ertragsentwicklung. So berichtete Salah Abou-Elwafa (Universität Kiel) über die Funktionsanalyse des BvFLK (Flowering Locus KH Domain) Gens für das mittels Expressionsstudien eine Beteiligung sowohl an der Wurzelentwicklung als auch an der photoperiodischen Induktion der Blütenbildung nachgewiesen werden konnte. Anhand transgener Arabidopsis-Pflanzen konnte letztlich die Relevanz von BvFLK für die Steuerung der Schosseigenschaft, sowie für die Expression des Vernalisationsgens AtFLC (flowering lochs C) bestätigt werden. Bemerkenswert war der beobachtet hohe Konservierungsgrad zwischen entsprechenden Regulationswegen aus Zuckerrübe und Arabidopsis.
Untersuchungen zur genetischen Regulation des Blühzeitpunktes wurden von Conny Tränker (Universität Kiel) vorgestellt. In den Jahren 2008 und 2009 wurden in Feldversuchen 396 Zuckerrüben-Akzessionen hinsichtlich Winterhärte und Schoßresistenz untersucht. Die dabei selektierte Akzession mit einer signifikant erhöhten Schoßresistenz bildete die Grundlage für umfangreiche Expressionsstudien, in Folge derer die beiden Gene BvFT2 und BvTFL1 als mögliche Kandidaten für die Kontrolle des Schossens identifiziert wurden.
Aus dem Bereich der Winterrapsforschung berichtete Christian Obermeier (Universität Giessen) über die Identifikation von drei Resistenz-QTL gegen die weitverbreitete Rapswelke (Verticillium longisporum). Ein wesentlicher Fortschritt für die Rapszüchtung liegt in der erfolgreichen Entwicklung von diagnostischen Markern für zwei dieser Resistenz-QTL (N15 und N11). Deren Zuverlässigkeit konnte bereits anhand von vier Doppelhaploiden (DH) Rapspopulationen mit jeweils unterschiedlichen Genomzusammensetzungen bestätigt werden. Da Wurzel und Hypokotyl eine prädestinierte Eintrittspforte für den bodenbürtigen Verticillium-Pilz darstellen, wurde mit ersten Untersuchungen zur möglichen Resistenzfunktion von Lignin und andere phenolische Komponenten des Hypokotyls begonnen.
Session 3: Omics Technologies and Applications
Den Auftakt zu dieser Vortragsrunde bildete ein Plenarvortrag, in dem die Entwicklung und die Einsatzmöglichkeiten der Zinkfinger Technologie für den ortsspezifischen Einbau von Transgenen, die Einführung kleinerer Insertionen, Deletionen, den Austausch einzelner Basen oder die Feinregulation von Genen (Vipula Shukla, Dow AgroSciences). Das System basiert auf der Eigenschaft von Zinkfinger Proteinen, die spezifisch an definierte Basensequenzen zu binden. In Kombination mit einer Typ II Endonuklease werden Doppelstrangbrüche an definierten Stellen im Genom verursacht, deren Reparatur so gesteuert werden kann, dass gezielt die genannten Veränderungen eingeführt werden können. Das Potential der bei Dow AgroScience entwickelten Methode liegt unter anderem in der Möglichkeit, Transgene an genau definierten Stellen im Genom einsetzen zu können. Einmal eingebaute Transgene können relativ einfach zu „gene stacks“ mit bis zu 6 Genen erweitert werden.
Am Beispiel der Identifizierung differentiell regulierter Transkripte in kältetoleranten bzw. anfälligen Nachkommen in einer spaltenden Nachkommenschaft bei Linsen wurden die Einsatzmöglichkeiten der SAGE Technologie aufgeführt. Vorteil dieser Methode, bei der kurze Sequenzabschnitte (ca. 25 bp) hintereinander kloniert und anschließend sequenziert werden, ist die Möglichkeit zur kostengünstigen und tiefen Sequenzierung von cDNA Bibliotheken. Aufgrund der geringen Abundanz der überwiegenden Mehrzahl der Transkripte sind Resequenzierungsstrategien, wie die geschilderte, eine attraktive Alternative zur Abschätzung der Expressionshöhe von Genen im Vergleich zu weniger sensitiven DNA-Chip Hybridisierungen (Björn Rotter, GenXPro).
Ein zunehmend verwendetes Verfahren zur funktionalen Genanalyse stellt die gezielte Identifizierung von Mutanten durch TILLING (Targeted Induction of Local Lesions in Genomes) dar. Am Beispiel der Gerste berichtete Sven Gottwald (Uni Giessen) über den aktuellen Stand der Arbeiten zur funktionalen Analyse neu erzeugter Allele in Kandidatengenen für das Merkmal Zeiligkeit (2-zeilig vs 6-zeilig) und zur Resistenz gegen den Barley Yellow Mosaic Virus Komplex.
Weitere Fortschritte wurden bei der Klonierung von Resitenzgenen gegen den Rübenzystennematoden gemacht (Gina Capistrano, Uni Kiel). Das Resistenzgen ist auf einem translozierten Chromosomenfragment aus der Wildrübe Beta procumbens lokalisiert, welches keine Rekombination mit dem Zuckerrübenchromosomen zeigt. Die Analyse von Mutanten erwies sich auch als entscheidender Schritt bei der Identifizierung eines Kandidatengens bei der Zuckerrübe für eine Resistenz gegen den Rübenzystenematoden.
Yonping Wang (Yangzhou University) berichtete über neue Ergebnisse bei der Entwicklung von Rapslinien mit Introgressionen aus Sinapis Alba, die neben Gelbsamigkeit auch eine Reihe verbesserter Ertragsparameter aufzeigten.
Bei Bassica rapa konnten mit Hilfe eines Integrierten Ansatzes aus Metabolomics, Transcriptomics, Qtl-Analyse und Assoziationskartierung erste Hinweise zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren gewonnen werden. Diese regulieren multiple Expressions-QTLs in „trans“ und könnten somit wichtige Schlüsselregulatoren für die weitere Verbesserung agronomischer Merkmale darstellen (Guusje Bonnema, Wageningen University).
Session 4: From Omics to Breeding
Die vierte Sektion zum Thema ‚From Omics to Breeding‘ begann mit einer „Key note Lecture“ von Michele Morgante (University of Udine), zur Analyse der genetischen Variation und ihrer Nutzung in der Pflanzenzüchtung. Am Beispiel der Re-Sequenzierung von Weinrebenarten wurde aufgezeigt wie die Genomik in naher Zukunft die Nutzung von Informationen basierend auf zehntausenden einzelnen Genen und Markern näher an die praktische Pflanzenzüchtung heranbringen kann. Es wurde dargelegt, wie die Technologie für die Katalogisierung kompletter Genomsequenzen und ausgewählter Genbereiche aus hunderten von Individuen sich stetig beschleunigt und effektive Verfahren zur Analyse der Variation und gezielten Modifizierung in Entwicklung sind, die die genetische Analyse komplexer Merkmale und gezielte Nutzung für die Pflanzenzüchtung erlauben werden.
Torben Schulz-Streeck (Universität Hohenheim) erläuterte am Beispiel eines typischen simulierten Datensatzes aus der Tierzüchtung und eines Datensatzes aus Mais mit 600 DH-Linien und 681 SNP-Markern wie die zunehmende Verfügbarkeit von umfangreichen genomweiten Markerdaten bei Verwendung verschiedener angepasster Modellierungsverfahren zukünftig Vorhersagen von relativen Zuchtwerten für die genomische Selektion in Kulturpflanzen erlauben kann.
Vor dem Hintergrund der mittlerweile möglichen Hochdurchsatz-Genotypisierung wurde in zwei weiteren Vorträgen dargelegt, dass die Phänotypisierung von Pflanzenmerkmalen derzeitig einen Engpass für die Genomik-basierte Züchtung darstellt und daher die Entwicklung digitaler Hochdurchsatz-Phänotypisierungsverfahren erforderlich ist. Joanna Post, Koordinatorin des CROP.SENSE.net-Projektes von der Universität Bonn, gab einen Überblick über ein Netzwerk von 35 Forschungsgruppen, das sich mit der Entwicklung und Anwendung zerstörungsfreier Sensoren und Technologien zur effizienten Hochdurchsatz-Phänotypisierung von züchtungsrelevanten Pflanzenmerkmalen bei Zuckerrübe und Gerste beschäftigt.
Marco van Schriek (Keygene, Wageningen) stellte die Anwendung einer bild-gestützten Hochdurchsatz-Phänotypisierungs-Plattform zur Wurzelentwicklung von Tomaten im Gewächshaus vor und beschrieb die Möglichkeit zur Marker-Entwicklung für neue Wurzelphänotypen in Tomaten-Kartierungspopulationen.
In drei weiteren Vorträgen wurden Beispiele angeführt wie Verfahren der Genomik bei der Entwicklung molekularer Marker und Bio-Marker in der Züchtung derzeitig und zukünftig genutzt werden können. Hermann Bürstmayr (Universität für Bodenkultur, Wien) zeigte auf, wie Marker-gestützte Züchtung erfolgreich zur Verbesserung der Fusarium-Resistenz in Winterweizen beitragen kann. Zwei Resistenz-QTL aus einer Sommerweizen-Linie konnten hier mittels marker-gestützter Selektion bei Verwendung QTL-spezifischer molekularer Marker durch Rückkreuzung in verschiedene Winterweizen-Sorten übertragen werden, ohne dass der Ertrag negativ beeinträchtigt wurde.
Maria von Korff (MPIPZ, Köln) erläuterte wie Trockenstress die Zeit bis zur Blüte und zur Reife in angepassten Gerste-Genotypen und welche Auswirkungen dies auf Biomasse und Ertrag hat. Eine Reihe von Kandidatengenen wurde identifiziert, die an der Kontrolle der Blütenbildung beteiligt und möglicherweise zur Entwicklung von Markern für die Marker-gestützten Selektion von Gerste mit Anpassung an trockene Standorte geeignet sind.
In der abschließenden „Key note lecture“ stellte Thomas Altmann (IPK Gatersleben) neueste Ergebnisse zur genetischen Analyse von Heterosis für Biomasse in Arabidopsis und Mais vor. Es wurde gezeigt, dass die Kombination von Metabolit- und SNP Daten in der Keimlingsentwicklung von Arabidopsis thaliana eine bessere Vorhersage der Hybridleistung im Vergleich zur ausschließlich auf molekularen Markern basierenden Vorhersage erlaubt. Auch bei Vorhersagen zur Heterosis von Biomasse bei Mais ergab die kombinierte Analyse eine erhöhte Genauigkeit und damit wertvolle Hinweise für die Entwicklung verbesserter Strategien für die Hybridzüchtung.
(Rod Snowdon, Sven Gottwald, Christian Obermaier, Andreas Graner (AG-Leiter))